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电针内关穴对内毒素休克肾组织诱导型NO合酶表达的影响
http://www.100kang.com 2007-5-5 9:50:09 电针


　　摘要：【目的】探讨电针内关穴对内毒素休克肾组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的作用。【方法】采用脂多糖(LPS)和D氨基半乳糖(DGalN)致敏的内毒素休克模型，应用免疫组织化学技术检测肾组织iNOS的表达，观察电针内关穴对内毒素休克肾组织iNOS表达的影响。【结果】电针内关穴组的肾组织iNOS的表达低于内毒素模型对照组（Ｐ＜００１）。【结论】电针内关穴能部分下调内毒素休克所致肾iNOS的过度表达，这可能是其治疗内毒素休克的机理之一。

　　关键词：休克，脓毒性／针灸疗法；肾／针灸效应；一氧化氮合酶／针灸效应；穴，内关；疾病模型，动物

　　一氧化氮(NO)为小分子气体物质，在体内极不稳定，其生物半衰期仅为4s，广泛参与体内的生理及病理活动。生物体内NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)以左旋精氨酸(Larginine)为底物而生成的。因此，NOS是NO合成的关键因素。NO过度生成则是细菌细胞壁中的脂多糖(LPS)成分诱导的内毒素休克的重要发病环节［１］。内关穴为中医针刺抗休克的常用有效穴位之一［２］，本实验从NOS角度，探讨电针内关穴对内毒素休克肾的保护作用，为临床治疗内毒素休克提供新的治疗方案。

　　1材料和方法

　　11  材料

　　健康普通级SpragueDawley大鼠24只，220～250g，雌雄不限，雌鼠未产未孕，由广州中医药大学实验动物中心提供；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，Sigma产品；兔源大鼠诱导型NOS(iNOS)单抗、链霉素亲和素生物素复合物法(streptaridinbiotin complex,SABC)免疫组化试剂盒、联苯二胺(DAB)试剂盒，武汉博世德生物工程有限公司提供。

　　12 分组及处理措施

　　24只大鼠随机分成模型组、电针内关组，每组12只。动物于实验前12h禁食，自由饮水，实验时腹腔注射水合氯醛(03mL/kg)麻醉，右颈总动脉分离，插PE50管，BL410生理仪观察并记录血压变化。

　　待10～20min血压稳定后，记录血压并定为记录0点，各组于尾静脉注射LPS 15mg·kg－１，腹腔注射D氨基半乳糖(ＤGalN) 100mg·kg－１，30min后电针“内关”穴。取穴方法按骨度分寸定位法，电针频率20Hz，持续脉冲电流，强度以双上肢规律性抖动为准，电针30min。

　　13 iNOS免疫组化反应

　　131 切片制备           

　　开胸，经升主动脉插管，先用生理盐水150mL冲去血液，继而灌注含40g/L多聚甲醛的01mol/L的磷酸缓冲液(PB，pH74)350mL，注毕立即取肾置于相同的新鲜灌注液中固定至组织块沉底，洗去表面的固定液，再取材，继之梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，石蜡切片，片厚10μm。

　　132 iNOS免疫组化反应(SABC法)           

　　(1)先烤片，恒温烤箱内60℃放置1h；(2)梯度脱蜡、脱水，PBS洗；(3)置于新鲜的体积分数为3%Ｈ２Ｏ２中10min灭活内源性过氧化物酶，双蒸水洗；(4)切片置于001mol／L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复25min；(5)冷却后，滴加抗原修复液，30min后，双蒸水洗；(6)滴加正常山羊血清60min，不洗，甩去多余液体；(7)滴加兔抗鼠iNOS一抗(1∶２０００，Sigma)，室温下(25℃)孵育1h，再4℃过夜，PBS洗；(8)滴加生物素化山羊抗兔IgG(博士德二抗试剂盒)，室温下60min，PBS洗；(9)滴加试剂SABC，室温60min，PBS洗15min×4次；(10)DAB显色，室温下20min，双蒸水多次洗涤；(11)脱水、透明，中性树胶封片。上述未提及的洗涤时间均为10min×３次。

　　133 免疫组化染色对照           

　　同一组切片中，分别用正常山羊血清和PBS代替iNOS一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查iNOS免疫反应的特异性。

　　14 结果分析

　　每只动物随机选10张切片，切片在统一放大倍数(1×40)下，合计其阳性细胞数。所得数据用SPSS软件进行统计学处理。
             
　　2 结果

　　21 内毒素对肾组织iNOS表达的诱导作用

　　iNOS阳性细胞均为胞浆染色，胞核不着色，对照反应未见阳性染色细胞。内毒素对照组iNOS阳性细胞数量多，肾小球毛细血管、肾小囊、肾间质血管内皮细胞质中iNOS免疫组化染色呈深棕褐色；肾近端小管管壁上皮细胞呈锥体形，细胞界限不清，胞浆呈深褐色而均匀；肾远端小管管壁上皮细胞呈立方体，细胞间界限清楚，胞浆亦呈深褐色而均匀，为iNOS强阳性表达(见表1、图1-a)。表1 两组肾组织iNOS免疫阳性细胞数比较（略）

　　22  电针内关穴对内毒素诱导肾组织iNOS表达的影响

　　结果见表1、图1-b。电针内关穴组阳性细胞数量少，与模型对照组比较，差别有显著性意义(P＜001)。部分肾小球毛细血管、肾间质内皮细胞胞质染色浅而均匀；肾近端小管管壁上皮细胞呈锥体形，细胞界限清楚，胞浆呈浅染色；肾远端小管管壁上皮细胞呈立方形，界限清楚，胞浆染色浅而均匀，为iNOS弱阳性表达。       

　　3 讨论

　　内毒素的化学本质是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖(LPS)成分，进入宿主血循环的内毒素，可激活全身的防御系统，包括血浆因子(补体和凝血因子)和细胞(中性粒细胞、单核巨噬细胞及内皮细胞)，而活化的细胞产生大量的NO导致严重的低血压反应［３］，这种逐步扩大的免疫反应和低血压引起的组织灌流不足最终导致多器官衰竭乃至死亡［4］。内毒素(LPS)刺激的NO过度产生为内毒素休克病理发生中关键性的中介机制。人对LPS十分敏感，但宿主为大、小鼠时，则敏感性很低，主要因其肝脏解毒功能较强，故本文造模时合用DGalN，引起一定程度的肝损伤，则可复制出内毒素休克模型。

　　31 内毒素诱导肾组织iNOS过度表达

　　NO是一种自由性质的气体，为较小的生物活性分子，可自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子。NOS是NO合成过程中的关键酶，目前已经确定的一氧化氮合酶的亚型有3种，分别由不同的基因编码。关于NOS亚型的命名，目前有多种方式，数字序号命名(NOSⅠ、Ⅱ、Ⅲ)是基于各型纯化和cDNA克隆的时间先后。描述性命名是基于原型酶的细胞或组织来源以及表达方式，分别称为神经元型NOS(neuronal NOS,nNOS)，诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)和内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS),nNOS和eNOS在细胞处于生理状态下即有表达，又合称为结构型NOS(constitutive NOS,cNOS)。iNOS一般情况不表达，但可被内毒素诱导激活［5］，iNOS持续产生大量的NO具有细胞毒性。大量生成的NO不仅可激活肾细胞鸟苷酸环化酶，还可导致DNA损伤、抑制线粒体呼吸以及降低含铁硫蛋白的酶活性；与超氧阴离子相互作用，产生过氧化亚硝酸基，并可扩散到肾组织，从而使NO成为内毒素休克肾细胞损害的主要介质。

　　本实验应用LPS和DＧalN建立的内毒素休克模型，有些动物出现尿血，提示有严重的肾脏损害，而肾组织iNOS免疫组化染色结果表明，肾组织iNOS表达显著增强，说明该模型大鼠存在肾组织iNOS的过度表达。

　　32 电针内关穴对内毒素诱导肾组织iNOS过度表达的影响

　　内关穴主治心痛、惊悸、神昏等，功能为回阳救逆，醒神定志。内毒素休克源于外源性的细菌感染，中医病机为邪盛内陷，内闭外脱。针刺内关穴能扶正祛邪，调和阴阳，疏通经络，使失调的气血津液或脏腑趋向正常状态。本实验发现，电针内关组肾组织iNOS表达显著低于对照组，表明电针内关穴可能对内毒素诱导的iNOS表达有部分抑制作用。目前使用的NOS抑制剂多为NOS底物左旋精氨酸的类似物，电针内关穴的作用机理可能是通过部分抑制“过亢”的iNOS，而不同于iNOS抑制剂的完全抑制作用；也不同于非选择性NOS抑制剂在抑制过量表达的iNOS的同时，也抑制了cNOS的作用。其确切的作用机制有待进一步深入研究。

　　参考文献：

　　［1］Cross S S,Wolin M S.Nitric oxide:pathophysiological mechanism［Ｊ］．Annu Rev Physiol,1995,57:737.

　　［2］夏保芦，程标．电针“内关”穴过敏性休克作用与脑内催产素含量的关系［Ｊ］．针刺研究，2001，26(1)：10．

　［3］Kilbourn R,Griffith O.Overproduction of nitric oxide in cytokinemediated and septic shock［Ｊ］．Ｊ　Ｎatl Cancer Inst,1992,84:827.

　　［4］Ｃasey L,Balk R.Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with sepsis syndrome［Ｊ］．Ann Int Med,1993,119:771.

　　［5］Anggard E.Nitric oxide:mediator,murderer,and medicine［Ｊ］．Lancet,1994,343:1199.

　　(１．广州中医药大学解剖教研室，广州510405；２．广东省深圳市中医院内科，深圳518033)

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：39970914)、广东省中医药管理局项目(编号：98447)及深圳市科技局项目(编号：200004087)文章编号：1007-3213(2004)01-0031-03


  
《广州中医药大学学报》2004年2月第20卷第1期