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参附注射液对心力衰竭老年兔心肌细胞凋亡影响的研究
http://www.100kang.com 2007-5-11 11:43:52 参附注射液


    【摘要】  目的  探讨参附注射液(Shenfu injection)对老年慢性心力衰竭家兔心肌细胞凋亡影响及其保护作用。  方法  新西兰老年兔22只，随机分为3组。假手术组（SH，n=6）；手术组（OP，n=8）：结扎腹主动脉复制心力衰竭模型；手术给药组（SF，n=8），分别于术后第1天起静脉给药。实验8周后，观察参附注射液对老年家兔慢性心力衰竭时心脏血流动力学（HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax）的影响，同时比较血浆心钠素（ANP）、肿瘤坏死因子α(TNFα)水平的变化及心肌细胞凋亡指数,心脏质量指数的变化。  结果  与SH组相比，OP组手术发生不同程度的心力衰竭症状，表现为心脏收缩功能的减退，心肌肥厚，同时ANP、TNFα水平及心肌细胞凋亡指数显著升高 (P<001)；SF组手术给药的血流动力学各项指标明显优于OP组，且心肌肥厚明显减轻，ANP、TNFα水平及心肌细胞凋亡指数显著减低(P<005)。  结论  参附注射液可显著改善老年慢性心力衰竭家兔的心功能，减轻心肌肥厚，其作用机制可能与其清除氧自由基，抗氧化，减少TNFα等炎性因子的释放，抑制心肌细胞凋亡有关。

　　【主题词】  参附注射液； 心力衰竭，充血性； 肿瘤坏死因子； 细胞凋亡

　    Effects of Shenfu injection on myocyte apoptosis in elderly rabbits with congestive heart failure   ZHENG Shiying, LI Hong, GE Jinfeng，ZHAO Jun.Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, the First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou  215006,China；ZHANG Xiaoying，DI Dongmei．the Third Affiliated Hospital of Suzhou University，Changzhou 213003，China

　　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  To study the effects of Shenfu injection on myocyte apoptosis in elderly rabbits with congestive heart failure．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Twentytwo elderly rabbits were randomly assigned to three groups: sham group(SH，n=6),operation group(OP，n=8),Shenfu group(SF，n=8). Except SH, the rabbit model of congestive heart failure was established  by constricting abdominal aorta. Rabbits in SF were injected with Shenfu  every day after operation.The parameters of hemodynamics(HR，LVSP，LVEDP，±dp/dtmax)and the content of ANP and TNFα in hematoplasma were measured after 8 weeks of treatment. Meanwhile, heart and LV weight to body weight ratio and left ventricle myocyte apoptosis rate were also examined.  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Commpared with SH,the cardiac contractile function in OP was significantly decreased, and the myocardial hypertrophy was emerged, yet the levels of plasma ANP and TNFα and the rate of  left ventricle myocyte apoptosis were significantly higher after 8 weeks (P<001). In comparison with OP, the cardiac contractile function in SF was significantly increased, and the levels of plasma ANP and TNFα and the rate of left ventricle myocyte apoptosis were significantly lower, and the myocardial hypertrophy were lessened (P<005).  Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  Shenfu injection can promote cardiac contractile function and lessen myocardial hypertrophy in rabbits with congestive heart failure. Its mechanisms may be associated with decreasing the releasing of TNFα and restraining myocyte apoptosis.

　　【Subject　ｗｏｒｄｓ】  Shenfu injection； Heart failure， congestive；  Tumor necrosis factor；  Apoptosis

    参附注射液是根据古方“回阳救逆”参附汤的中药配方，用红参、黑附子经科学加工提炼而成， 其主要有效成分是人参皂甙和乌头类生物碱，因其不良反应小和“多靶效应”而广泛应用于临床，在抗休克和防治缺血再灌注损伤方面效果显著［1］。本实验旨在观察参附注射液对慢性心力衰竭(CHF)的作用，并探讨其可能机制。

　　1  材料与方法

    1.1  材料  选用健康纯种新西兰老年兔（兔龄36月）22只，体质量20~25 kg，雌雄各半，由苏州大学动物实验中心提供。999参附注射液 (10ml/支)，由雅安三九药业公司提供。肿瘤坏死因子α(TNFα)试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL），由武汉博士德生物工程公司提供。

    12  动物模型制备及分组  参照Anversa等［2］方法复制腹主动脉缩窄心衰模型。实验兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 ml/kg）麻醉，取腹部正中切口,分离肾动脉上方的腹主动脉约1 cm长，用7号针头紧贴腹主动脉平行放置，并将两者一起结扎，然后抽出7号针头,使腹主动脉部分狭窄。实验动物随机分为3组。假手术组（SH组)：6只，仅开腹并分离腹主动脉，但不予结扎；手术组（OP组)：8只，结扎腹主动脉复制心衰模型；手术给药组（SF组)：8只，结扎腹主动脉复制心衰模型，于术后第1天起静脉注射参附注射液［8 ml／(kg·d)，10 min内注完］。SH组和OP组注射等量生理盐水，1次／d，连续用药8周。

    13  观察指标

    131  观察术后动物的一般情况（食欲、精神、毛发情况、活动等），并于8周后再次麻醉动物，行左颈总动脉插管，逆行插至左心室，导管通过血压换能器连接MPAV型多道生物信号分析系统（第二军医大学出品），描记血压及同步描记左室内压力曲线和微分曲线。读取心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)及舒张压(LVEDP)和左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(dp/dtmax)等血流动力学指标。

    132  经颈动脉抽血测定血浆心钠素（ANP）、TNFα水平（放射免疫分析法）。

    133  抽血后于耳缘静脉注射空气5 ml处死动物，摘取心脏，分别称取全心及左心室湿质量(HW、LVW)，计算心质量指数：全心湿质量(g)／体质量(kg)(HW／BW)、左心室湿质量(g)／体质量(kg)(LVW／BW)。

    134  预留左室心尖部心肌一块约200 mg，迅速置于-196℃液氮中保存，以备病理切片，使用TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数［每份标本随机取10张切片进行检测。采取末端脱氧核苷酸转换酶(TdT)介导的2′脱氧核苷尿嘧啶5′三磷酸(dUTP)—生物素平移末端标记技术－TUNEL标记凋亡细胞。按照武汉博士德生物工程公司凋亡检测试剂盒实验步骤操作。判断标准：棕黄色或棕褐色细胞核者为凋亡细胞，紫蓝色细胞核为非调亡细胞。在200倍镜下计出平均每高倍镜下细胞总数及凋亡细胞数，算出凋亡细胞率］。

    14  统计学处理  采用SPSS 100统计软件进行分析，所有数据均用均数±标准差（±s）表示，组间比较用方差分析，P<005认为差异有统计学意义。

    2  结果

    21  一般生存情况  2 d后各组动物均恢复进食，2周后可见OP组动物活动减少，进食减少，反应迟钝，毛疏松粗糙，其余各组变化不明显；第4周后OP组有1只动物死亡，解剖见其心脏增大，肺充血，胸水约15 ml，肝肿大。

    22  左室血流动力学指标的变化  结果见表1。动物饲养8周后，与SH组相比，OP组发生不同程度的左室收缩功能障碍，表现为LVEDP、HR显著增加；LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著下降，差异有统计学意义（P<001）。同时比较SF组手术给药，其相应指标与手术组相比，LVEDP、HR显著下降，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著增加（P<005）。表1  3组左室血流动力学指标的变化比较结果见表2。OP组与SH组比较，心肌出现不同程度肥厚，表现为LVW／BW及HW／BW的增加（P<001）；SF组虽也存在LVW／BW及HW／BW增加，但较手术组明显减轻

    24  ANP、TNFα水平的变化  结果见表3。OP组ANP水平明显高于SH组（P<001）；SF组ANP水平升高明显小于OP组（P<005）。TNFα水平的变化与ANP水平的变化相似。表3  3组ANP和TNFα水平变化比较表4  3组左心室心肌细胞凋亡指数变化比较

　　3  讨论

    CHF是一种以心室功能不全、神经内分泌激活和外周血流分布异常为特征的复杂的临床综合征。当各种因素作用于心肌细胞引起不可逆损伤后，心肌细胞进行性减少，纤维组织形成，左心室重构，最终心力衰竭恶性进展。心力衰竭的决定性机制是心室重构［3］，心肌丧失及其间质异常是心室重构的两大病理特征。心肌细胞数量减少，可使心肌收缩力下降，导致CHF 的发生；并使存活的心肌细胞负荷加重、心室重构，使CHF进行性恶化［4］。细胞凋亡(apoptosis) 又称细胞程序性死亡，心肌细胞凋亡是引起心肌细胞数目减少的重要原因［5］。研究表明，在高龄、缺氧、缺血再灌注、心肌梗塞、肥厚性心肌病等情况下都发现有凋亡心肌细胞的增加，终末期心衰患者心脏细胞凋亡更较常人增加232倍［67］。本实验通过缩窄老年家兔腹主动脉复制压力型CHF模型，结果显示：实验8周后，OP组出现不同程度的心力衰竭症状，表现为左室收缩功能障碍：LVEDP、HR显著增加；LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著下降（P<001）。LVW／BW及HW／BW指数增加（P<001），提示左室心肌肥厚。TUNEL法检测左室心肌，发现OP组心肌细胞凋亡率较SH组明显增加。而在添加参附注射液的手术给药组中，其心力衰竭及心肌肥厚程度较OP组明显减轻，心肌细胞凋亡率虽高于SH组，但较OP组明显下降（P<005）。说明：慢性心衰过程可发生心肌肥厚、诱导心肌细胞发生凋亡，参附注射液可抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌肥厚，延缓心衰的发展，保护心功能。ANP是心房肌细胞产生和分泌的一种激素，可作为判断慢性心衰严重程度、检测抗心衰药物疗效的指标［8］。TNFα 是一种主要由单核巨噬细胞分泌的具有多种生物学效应的细胞因子，心脏巨噬细胞和心肌细胞均可产生TNFα。大量研究表明，在缺血、压力超负荷等应激刺激下心肌的TNFα表达增加［9］，在CHF缺血再灌注损伤，病毒性心肌炎和心脏移植排斥等情况下心肌自动产生TNFα［10］，心衰时外周TNFα生成增加［11］。Vadlamani等[12]认为，TNFα可促进心衰心脏的重塑，可诱导细胞凋亡而影响心功能，与心衰的发生、发展密切相关。从实验中我们发现，OP组血浆ANP水平、TNFα水平较SH组显著升高（P<001），且与其心力衰竭严重程度相一致；予以参附注射液处理的SF组，其血浆ANP水平、TNFα水平较OP组明显下降，与心力衰竭减轻程度相一致。说明，参附注射液的抗心衰、抗心肌细胞凋亡作用可能与其减少CHF时外周TNFα的生成有关。至于参附注射液如何下调TNFα的生成及表达，目前尚未完全阐明，可能与其主要成分人参皂甙清除氧自由基，抑制脂质过氧化物产生有关［13］。

    参考文献

    ［１］  刘先义,邹捍东，余金甫，等．参附注射液对缺血再灌注家兔多脏器损伤的治疗作用[J]．中华麻醉学杂志，1997，17（7）：340．

    ［2］  Anversa P,Hagopian M，Loud AV．Quantitative radioautographic localizion of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy[J]．Lab Invest，1973,29(3):282．

    ［3］  Greenberg B．Treatment of heart failure:State of the art and prospectives[J]．J Cardiovasc Pharmacol,2001,38(Suppl 2):S59．

    ［4］  Braunwald E．Heart diseade(5th ed)．Philadephia saunder．1997(Science Press,Beijing China)．1999：360373,394．

    ［5］  Sabbah HN．Apoptotic cell death in heart failure[J]．Cardiovasc Res,2000,45(3)：704．

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    ［9］  Cicoira M,Bolger AP,Doehner W,et al．High tumour necrosis factoralpha levels are associated with exercise intolerance and neurobormonal activation in chronic heart failure patients[J]．Cytokine,2001,15(2):80．

    ［10］Meldrum DR． Tumor necrosis factor in the heart [J ]． Am J Physiol,1998,274(3 Pt 1):R577．

    ［11］Grossman GB,Rohde LE,Clausell N．Evidence for increased peripheral production of tumor necrosis factoralpha in advanced congestive heart failure[J]．Am J Cardiol,2001,88(5):578．

    ［12］Vadlamani L,Abraham WT． Insights into pathogenesis and treatment of cytokines in cardiomyopathy [J]． Curr Cardiol Rep,2000,2(2):120．

    ［13］刘先义,胡刚，夏中元，等．参附注射液对肠缺血再灌注大鼠肿瘤坏死因子α的影响[J]． 临床麻醉学杂志，2004， 20(10): 611．

    　 基金项目：中华人民共和国卫生部999中药科技基金招标项目（200308）

    作者单位：215006江苏省苏州市，苏州大学附属第一医院(郑世营，李虹，葛锦峰，赵军)；213003江苏省常州市，苏州大学附属第三医院(张晓膺，狄冬梅)


  
《实用老年医学》2006年12月第20卷第6期