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rhBMP7对人真皮成纤维细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响
http://www.100kang.com 2007-5-30 17:33:05 骨形成蛋白;


　　[关键词]骨形成蛋白; 碱性磷酸酶; 细胞增殖

　　碱性磷酸酶（ALPase）的活性是成骨细胞分化成熟的重要标志之一, 其活性的高低可反映细胞钙化的能力和向成骨细胞分化的趋势[1]。重组人骨形成蛋白（rhBMP）可刺激成骨细胞、 类成骨细胞及已分化的骨细胞, 促进其增殖、 胶原合成以及细胞中碱性磷酸酶和骨钙素的表达升高[2]。本实验中主要探讨了大肠杆菌表达的rhBMP7, 经纯化、 复性处理后, 对人真皮成纤维细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  ETX480酶联检测仪为BIOTEK公司产品。细胞培养瓶、 96孔细胞培养板为Costor公司产品。RPMI1640培养基、 胎牛血清、 青、 链霉素、 胰蛋白酶皆为Gibco公司产品。二甲基亚砜、 噻唑蓝、 对硝基苯磷酸盐（PNPP）均为Sigma公司产品。BMP7标准品购自RD公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人真皮成纤维细胞的原代培养  手术切取唇裂患者的唇皮, 用无血清RPMI1640培养液冲洗数遍后, 以灭菌剪刀剪为1 mm×1 mm×1 mm的碎片, 移入含10 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640完全培养基中, 倒置放入37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中。2～4 h后, 反转细胞培养瓶继续培养, 隔1 d换新鲜RPMI1640完全培养液1次。培养6 d后, 可见有细胞芽游出, 待细胞长满瓶底后, 用2.5 mg/L的胰酶常规消化传代培养, 传至第3代用于实验[3, 4]。

　　1.2.2  碱性磷酸酶活性的测定  采用PNPP底物比色法[5, 6]。取第3代的人真皮成纤维细胞株, 接种于含10 mL/L FBS的RPMI1640完全培养液中, 置37℃、 50 mL/L CO2孵育箱中培养。待细胞增殖至对数生长期时, 用2.5 mL/L的胰酶消化后, 加4 g/L的台盼蓝计数活细胞的比例, 将细胞的密度调整至1×108个/L接种于96孔培养板中, 每孔加100 μL, 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养过夜,   加入等量不同浓度的待测样品。同时设置BMP7标准品为阳性对照, PBS为阴性对照。继续分别培养48 h和72 h后, 吸弃原培养液, 用PBS洗涤后, 每孔加入50 μL细胞裂解液, 置-70℃冰箱中反复冻融3次。然后加入50 μL PNPP底物液于37℃反应30 min, 加入50 μL 1.25 mol/L NaOH终止反应, 于405 nm波长处比色测定A值。

　　1.2.3  活细胞增殖的MTT比色法测定  将人真皮成纤维细胞培养至对数生长期, 用PBS洗1遍, 加入2.5 mg/L的胰酶消化后, 用吸管将细胞均匀吹散, 配制密度为1×105的细胞悬液, 接种于96孔培养板中, 置37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养过夜, 第2天换新鲜培养液（清除死细胞）。实验分为3组, 即实验组、 阳性对照组及阴性对照组, 每组8个重复孔（其中2个孔台盼蓝染色做活细胞计数统计）。实验组:   加入不同浓度（700、 70、 7、 0.7、 0.07 μg/L）的rhBMP7 样品上清液, 阳性对照组加入7.0 μg/L BMP7标准品, 阴性对照组加入PBS。分别培养48 h和72 h, 每孔加入20μL5g/L MTT置37℃孵育4 h后, 加入150 μL/孔 DMSO, 振荡10 min, 用酶联检测仪于490 nm波长下检测吸光度（A）值[7], 并计算细胞的增殖率（%）。增殖率=（实验组的A值/对照组的A值）×100%。同时观测细胞线粒体中蓝紫色结晶体的数量。

　　1.2.4  统计学处理  检测结果均采用SPSS10.0统计软件处理, 数据以x±s表示; 组间比较采用配对t检验, P<0.05具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  rhBMP7对碱性磷酸酶活性的影响    PNPP底物比色法测定结果表明, 0.07～700 μg/L rhBMP7各实验组碱性磷酸酶活性的A值为（0.33±0.03～0.59±0.05）, 阴性对照组为（0.23±0.06）, 实验组均高于阴性对照组, 其中7.0 μg/L及 70 μg/L两组的结果与阴性对照组相比较有统计学意义（P<0.01）; 但与阳性对照组比较无统计学差异（P>0.05, 表1）。

　　2.2  rhBMP7对成纤维细胞增殖的影响  MTT比色法测定表明, rhBMP7对体外培养的成纤维细胞具有明显的促增殖作用。rhBMP7各浓度实验组中成纤维细胞的增殖均高于阴性对照组, 其中7.0 μg/L及70 μg/L两组的结果与阴性对照组比较有统计学差异（P<0.01）, 而与阳性对照组比较无统计学差异（P>0.05, 表1）。另外, 检测结果还表明, 细胞的线粒体中形成的蓝紫色结晶体的数量及密度均较阴性对照组多而密（图1）。

　　表1  不同浓度的rhBMP7对成纤维细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响（略）

　　bP<0.01 vs 阴性对照组.

　　图1  rhBMP7处理的成纤维细胞线粒体中蓝紫色结晶体数量的变化（略）

　　A: 实验组（70 μg/L的rhBMP7); B: 阴性对照组（PBS）.

　　3  讨论

　　本研究参照文献[1, 3]报道的BMP对牙周细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响, 以及rhBMP2对人牙周膜成纤维细胞的作用[8], 改用培养的第3代人真皮成纤维细胞, 探讨了rhBMP7的生物学活性。MTT比色法, 是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使淡黄色的MTT分子还原为不溶性蓝紫色结晶体（甲月替）, 且形成的量与细胞的数量及活性呈正相关的关系, 通过比色测定即可反映出活细胞的数量及活性[1]。本研究的结果表明, rhBMP7可促进培养的人真皮成纤维细胞增殖, 培养24 h时增殖不明显, 培养72 h时出现平台, 培养48 h时增殖率达最高峰。另外, rhBMP7作用后细胞增殖的程度与接种的细胞的密度有关, 细胞接种密度为8000～10000个/孔时较适合。ALPase活性检测的基本原理是, ALPase在特定的条件下, 可以将其底物PNPP分解成PNP(对一硝基苯酚)和磷酸盐, 其中PNP呈黄色, 根据颜色的深浅来反映活性程度。此反应是一种进行性过程, ALPase的活性与PNP生成率呈正相关, 国际通用标准单位是以每分PNP生成的量来表示的, 测得的直接数据是PNP的A值。为保证ALPase活性检测的准确性, 从方法学的角度要做到酶与底物的反应时间精确, 酶与底物的配比适当[5]。本实验说明, 于成纤维细胞悬液中加rhBMP7培养48 h后, 碱性磷酸酶的表达明显高于阴性对照 组(P<0.01)。rhBMP7对成纤维细胞的增殖和碱性磷酸酶活性都有一定的促进作用, 但rhBMP7在70～70 μg/L这个浓度范围内, 其对碱性磷酸酶活性的表达和成纤维细胞增殖的促进作用最显著。BMP作为TGFβ超家族的成员, 可诱导异位宿主间充质细胞分化为软骨和骨, 对胚胎骨骼的发育和再生修复均具有重要的作用, 诱导的骨生成蛋白大多集中于BMP2、 4、 7[3]。其中rhBMP7在体内和体外都显示有高效的诱导骨形成的活性, 临床上已试用于骨折和骨缺损的治疗[9]。Asahina等[10]在胎鼠颅骨细胞软骨成骨模型中, 观察到BMP7可分阶段特异性地诱导原始成骨祖细胞定向分化, 使碱性磷酸酶的活性和骨钙素的表达升高。随着基因工程技术的进展, 研究rhBMP在细胞遗传学与生物学中具有广泛的应用价值。陈文等[11]报道, 目前国外已研制出10余种BMP, 其中以对BMP2和BMP7（OP1）的研究报道最多, 但以后者的作用最为广泛, 其可异位或在位诱导骨、 牙本质、 牙骨质的生成,    促进骨缺损的修复, 具有广阔的临床应用前景。

　　参考文献:

　　[1] 王勤涛, 史俊南, 吴织芬, 等. 骨形成蛋白对牙周细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1996, 6（3）: 153-155.

　　[2] 张  翠, 韩金祥, 宋长征, 等. 真核表达骨形成蛋白的条件优化[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2003, 19（2）: 208-209.

　　[3] 李德华, 刘宝林, 吴军正, 等. 人胚成骨细胞体外原代培养和鉴定[J]. 中华口腔医学杂志, 1998, 8（2）:  92-94.

　　[4] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 西安: 世界图书出版公司, 1996: 118-227.

　　[5] 李德华, 刘宝林, 吴军正, 等. 体外培养的成骨细胞中碱性磷酸酶活性的检测方法探讨[J]. 实用口腔医学杂志, 1997, 13（1）: 21-23.

　　[6] 苏  勤, 何国华, 孙叶芳, 等. 人重组骨形成蛋白1对牙髓细胞生物学效应的研究[J]. 华西口腔医学杂志, 1997, 15（4）: 300-302.

　　[7] 孙卫民, 王惠琴. 细胞因子研究方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1999: 53-86.

　　[8] 司小辉, 刘  正. 重组人骨形成蛋白2对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用[J]. 华西口腔医学杂志, 2002,  20（1）: 10-14.

　　[9] 王  健, 韩金祥, 吴惠联. 高效的骨诱导生长因子成骨蛋白1[J]. 中国生物化学与生物物理进展, 1999, 20(3): 205-207.

　　[10] Asahina I, Sampath TK, Hauschka PV. Humanostelgen: c protein1 tnduces chondrobl ast, lsteoblastic and/or adirocytic differentiation of cional murine target cells[J]. Exp Cell Res, 1996, 222(1): 38-47.

　　[11] 陈  文, 史俊南, 付士红. 人成骨蛋白1成熟肽基因5'端的修饰及其在大肠杆菌中的表达[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1998, 8（1）: 3-6.

　　基金项目: 国家高技术研究发展计划（863）项目（TB01 2003AA22353）

　　（国家卫生部生物技术药物重点实验室, 山东省现代医用药物与技术重点实验室, 山东省医药生物技术研究中心, 山东 济南 250062）


 


  
《细胞与分子免疫学杂志》2007年3月第23卷第3期