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构建EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体并在HEK29316工程细胞株中定点整合表达
http://www.100kang.com 2007-5-30 17:30:52 定点整合表达;


　　Development of recombinant HEK29316 cell strain expressing chimera receptor EpoR/LRF3/HAb18GEFwithsitespecific integration expression system

　　ZHAO Pu, ZHANG Sihe*, Jan Tavernier, LI Yu, CHEN Zhinan*

　　Department of Cell Biology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China; Department of Medical Protein Research (VIB09), Ghent University, Baertsoenkaai B9000 Ghent, Belgium

　　[Abstract]  AIM: To establish recombinant HEK29316 cell strain expressing chimera receptor EpoR/LRF3/HAb18GEF via sitespecific integration expression system. METHODS: The HAb18GEF gene fragment was amplified by PCR and digested with Sac I/Not I, and then cloned into the multiple clone site downstream of EpoR/LRF3 gene of eukaryotic expression vector pCEL2f. The obtained pCEL2f/HAb18GEF vector, checked by partial nucleotide sequencing and restriction endonuclease digestion, was cotransfected with POG44 vector into HEK29316 cells by mixing with Lipofect AMINE2000 reagent. After selection with hygromycin B for one month, transient and stable expression of EpoR/LRF3/HAb18GEF were detected by indirect immunofluorescence staining, flow cytometry assay, and Zeocin test. RESULTS: The recombinant pCEL2f/HAb18GEF vector, containing fused EpoR/LRF3/HAb18GEF gene with correct open reading frame, was successfully constructed. It was confirmed that both EpoR and HAb18GEF were expressed efficiently on the membrane of cotransfeced HEK29316 cells. 12 stablyexpressed clones, sensitive to Zeocin, were finally obtained, which presented 9993% EpoRpositive cells with strong immunofluorescence intensity of 103639, and simultaneously presented 9951% HAb18GEFpositive cells with strong immunofluorescence intensity of 65272. CONCLUSION: HEK29316 cell strains stably expressing EpoR/LRF3/HAb18GEF chimera receptor have been developed successfully, which lays foundation for MAPPIT (Mammalian proteinprotein interaction trap) screening of binding molecule of hepatoma associated antigen HAb18G/CD147.

　　[Keywords]sitespecific integration expression; EpoR/LRF3/HAb18GEF; HEK29316 cell

　　[摘 要]  目的: 构建EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体, 并在HEK29316工程细胞株中定点整合表达。方法: 用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因, Sac I/Not I双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中, 构建EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEF, 并经酶切和测序验证。将此重组表达载体与POG44载体（按1∶9的比例混合后）, 在阳离子脂质体介导下共转染HEK29316工程细胞, 用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LRF3/HAb18GEF cDNA的细胞克隆。用间接免疫荧光染色法、 流式细胞术及Zeocin致死试验, 检测并验证稳定表达株中EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体的表达。结果: 成功地构建pCEL2f/HAb18GEF真核重组表达载体, 共转染后EpoR、 HAb18GEF均高效表达于转染的HEK29316细胞的胞膜上。经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LRF3/HAb18GEF的稳定株, 其表达EpoR的阳性率为9993%, 平均荧光强度（MFI）为103639, 表达HAb18GEF的阳性率为9951%, MFI为65272, 且可被Zeocin致死。结论: 成功地建立了表达EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体的HEK29316工程细胞株, 为进一步利用哺乳动物蛋白质蛋白质相互作用陷阱（MAPPIT）系统筛选HAb18G的作用受体奠定了基础。

　　[关键词]定点整合表达; EpoR/LRF3/HAb18GEF; HEK29316细胞

　　HAb18G/CD147分子为本室用抗肝癌单克隆抗体（mAb）HAb18筛选人cDNA文库获得的一种新的肝癌相关抗原, 高表达于人肝癌组织和一些转移性肝癌细胞的表面[1]。研究表明: （1）HAb18G/CD147分子可刺激人成纤维细胞产生明胶酶, 促进人肝癌细胞的浸润与转移。（2）高表达的HAb18G/CD147分子可通过降低NO/cGMP对Ca2+库依赖的Ca2+内流调控的敏感性而增强人肝癌细胞的转移潜能。（3）MAPK信号通路、 FAK、 整合素及微丝, 均参与了HAb18G/CD147分子诱导人成纤维细胞产生明胶酶的过程[2-4]。HAb18G/CD147分子可介导肝癌细胞与间质成纤维细胞间信号传导的多个远端环节, 但作为这些效应细胞间信号通讯的关键分子, 能与HAb18G胞外区（HAb18GEF）直接结合的受体尚不清楚。哺乳动物蛋白质蛋白质相互作用陷阱（mammalian proteinprotein interaction trap, MAPPIT）是基于Ⅰ型细胞因子受体的JAKSTAT信号传导机制而设计的新型蛋白双杂交系统。与传统的体内、 外筛选方法相比较, MAPPIT系统的筛选是在真核细胞生理状态（正确构象, 正确糖基化）下而进行的, 不仅避免了因细胞裂解带来的蛋白结构的改变（膜蛋白破坏）或错误的相互作用（与细胞质蛋白结合）, 而且因将结合结构域及效应结构域分开而避免了假阳性, 具有非常高的灵敏性和有效性[5-7]。本研究中构建了EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体, 并在HEK29316工程细胞株中定点整合表达, 为进一步利用MAPPIT系统筛选HAb18G/CD147分子的受体奠定了基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  质粒pBlukscript 18KS(+)/HAb18G、 E.coli JM109、 抗HAb18G/CD147胞外区鼠源mAb  HAb18, 均由本室构建或保存。pCEL2f真核表达载体(含Flp重组靶位点)、 HEK29316工程细胞株[5](基因组整合有FRT盒), 来自比利时根特大学医学系。真核表达质粒pOG44(表达Flp重组酶)由军事医学科学院生物工程研究所陈昭烈研究员惠赠。pMD18T Simple载体购自TARKARA公司。抗EPO受体胞外区鼠mAb 307购自R&D公司。抗Annexin II鼠源mAb 8061购自Zymed公司。限制性内切酶Sac I、 Not I、 Taq DNA 聚合酶及T4 DNA连接酶等, 购自大连宝生物工程有限公司。质粒提取试剂盒与凝胶回收试剂盒均购自Promega公司。抗生素Zeocin、 潮霉素B、 Lipofect AMINE2000脂质体及胎牛血清均购自Invitrogen公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  引物设计与合成  根据HAb18G胞外区基因的序列, 用Primer5.0软件设计下列引物, 引物由Invitrogen 公司合成。上游引物的序列为: 5′AAGTAGCGAGCTCGGCTGCCGGCACAGTC3′; 下游的引物序列为: 5′TAATAGCGGCCGCTTAGTGGCTGCGCACGCG3′; 划线部分别为Sac I和Not I的酶切位点。

　　1.2.2  HAb18G胞外区基因的扩增及序列测定  以pBlukscript 18KS(+)/HAb18G质粒为模板, 用设计的上下游引物进行PCR扩增。PCR反应的体积为: 3 μL 质粒模板、 3 μL 10×PCR反应缓冲液、 100 μmol/L dNTP、 5μmol/L引物及1U Taq DNA聚合酶, 总体积30 μL。PCR反应条件为: 94℃预变性4 min, 然后94℃ 45 s , 57℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共30个循环后, 于72℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离、 切胶回收纯化后, 克隆到pMD18T Simple载体中, 送Invitrogen公司进行DNA序列测定。

　　1.2.3  重组表达质粒pCEL2f/HAb18GEF的构建和鉴定  用Sac I/Not I分别酶切pMDT/HAb18GEF和pCEL2f重组质粒。酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离后, 切胶回收纯化目的片段, 加入T4 DNA连接酶, 于16℃连接反应过夜。按常规方法[8]转化感受态E.coli JM109菌株, 随机挑取阳性菌落, 扩大培养后, 大量提质粒并以Sac I/Not I酶切鉴定, 酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.4  细胞转染与抗性克隆的筛选  以2.5×105个/孔铺HEK29316细胞于24孔板（含150 mL/L FCS, 不含抗生素）DMEM培养液培养过夜。次日将pOG44和pCEL2f/HAb18GEF重组质粒按质量比9∶1混合。取08 μg混合质粒, 用2 μL LipofectAMINE2000脂质体转染HEK29316细胞; 同时以质粒POG44和POG44+pCEL2f质粒分别转染HEK29316细胞作为对照。继续培养20  h并按1∶5传代培养2 d后, 加100 mg/L潮霉素B连续筛选培养3周, 每周换液2次, 用有限稀释法对筛选的抗性细胞克隆进行克隆化。

　　1.2.5  EpoR/LRF3/HAb18GEF的定点整合表达  参照文献[9]的方法进行。收集转染后48 h的HEK29316细胞, 一部分细胞经兔血清封闭后, 以抗EpoR胞外区mAb为一抗, 以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗, 检测EpoR的表达; 另一部分细胞先用40 g/L多聚甲醛固定、 1 g/L saponin(PBS)打孔液处理7 min、 再用兔血清封闭胞内FcR后, 用HAb18进行间接免疫荧光染色分析。经传代培养筛选的抗性细胞克隆, 用流式细胞术检测EpoR、 HAb18GEF蛋白的表达(以无关抗Annexin II mAb为对照)。同时, 取部分阳性克隆细胞加入Zeocin, 验证融合基因在抗性克隆的基因组中的整合表达。

　　2  结果

　　2.1  HAb18G胞外区基因扩增及序列测定  PCR成功扩增HAb18GEF基因, 大小约580bp(图1)。对重组pMD18T Simple载体DNA测序表明, 插入序列与GenBank中CD147的核苷酸序列完全一致（图2）。

　　图1  HAb18GEF基因扩增产物的10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析（略）

　　Fig 1  Ananlysis of PCR product of HAb18GEF gene by agarose gel electrophoresis

　　1: DL2000 DNA marker; 2: HAb18GEF gene; 3: Negative control.

　　图2  pMD18T/HAb18GEF插入片段的核苷酸序列分析（略）

　　Fig 2  Analysis of partial nucleotide sequence of the inserted fragment in pMD18T/HAb18GEF

　　Note: Boldfaced nucleotides are primer sequence; Underlined nucleotides are HAb18GEF sequence.

　　2.2  pCEL2f/HAb18GEF的构建和酶切鉴定  用Sac I/Not I酶切pMDT/HAb18GEF和pCEL2f质粒,酶切产物经切胶纯化回收目的片段。将HAb18GEF和pCEL2f酶切纯化后的片段连接并转化感受态E.coli JM109菌株, 提质粒后获得重组质粒pCEL2f/HAb18GEF。以Sac I/Not I酶切后电泳表明, HAb18GEF cDNA片段已正确插入pCEL2f载体的相应酶切位点, 大小约为580bp, 为单拷贝插入(图3）。

　　图3  重组真核表达质粒pCEL2f/HAb18GEF的限制性酶切鉴定（略）

　　Fig 3  Restriction enzyme digestion analysis of recombinant eukaryotic expression vector pCEL2f/HAb18GEF

　　1: DL2000 DNA marker; 2: pCEL2f/HAb18GEF/Sac I+Not I.

　　2.3  EpoR/LRF3/HAb18GEF融合蛋白的表达  免疫荧光染色表明, 以POG44和pCEL2f/HAb18GEF共转染48 h后, HEK29316细胞中可见明显的绿色荧光（图4）, 说明瞬时转染后EpoR和HAb18GEF蛋白均有表达。对传代10次的稳定克隆株用流式细胞术检测表明, 表达EpoR的细胞的阳性率为9993%, 平均荧光强度（MFI）为103639, 表达HAb18GEF的细胞的阳性率为9951%, MFI为65272（图5）。Zeocin致敏实验表明, 所得抗性克隆全部可被Zeocin致死, 说明EpoR/LRF3/HAb18GEF融合基因与HEK29316细胞的基因组整合表达。

　　图4  不同质粒转染的HEK29316细胞的免疫荧光染色检测（略）

　　Fig 4  Immunofluorescence staining detection of HEK29316 cells transfected with different plasmids (×400)

　　A: mAb HAb18detected cells transfected with POG44+pCEL2f/HAb18GEF; B: mAb HAb18detected cells transfected with POG44+pCEL2f; C: mAb HAb18detected cells transfected with POG44; a: mAb 307detected cells transfected with POG44+pCEL2f/HAb18GEF; b: mAb 307detected cells transfected with POG44+pCEL2f; c: mAb 307detected cells transfected with POG44.

　　图5  稳定表达EpoR/LRF3/HAb18GEF融合基因的HEK29316细胞的流式细胞术分析（略）

　　Fig 5  FCM analysis of HEK29316 cells of stablyexpressed EpoR/LRF3/HAb18GEF

　　A: mAb 307detected cells transfected with POG44+pCEL2f; B: mAb HAb18detected cells transfected with POG44+pCEL2f; C: mAb 8061detected cells transfected with POG44+pCEL2f; D: mAb 8061detected cells transfected with POG44+pCEL2f/HAb18GEF;  E: mAb 307detected cells transfected with POG44+pCEL2f/HAb18GEF; F: mAb HAb18detected cells transfected with POG44+pCEL2f/HAb18GEF.

　　3  讨论

　　MAPPIT筛选系统的主要策略是利用活化的JAK激酶使细胞因子受体胞内区的STAT募集位点磷酸化, 通过将“诱饵”蛋白（本实验中为HAb18GEF）融合在细胞因子受体（如EpoR/LRF3, 其STAT3募集位点均已突变）的胞内端, 而将“猎物”蛋白（如成纤维细胞来源cDNA文库表达克隆）与另一细胞因子受体片段（如gp130, 其STAT3募集位点均正常）融合成嵌合体。如果“诱饵”与“猎物”能相互作用结合, 外加相应的细胞因子刺激后, 激活的JAK激酶将带有“猎物”的嵌合体上的正常STAT3募集位点磷酸化,  继而募集并激活大量的STAT3分子, 诱导受控于STAT响应启动子下的报告基因大量转录[5]。考虑到HAb18G/CD147诱导成纤维细胞产生MMP时, 必须依赖于其胞外区N糖基化, 且可能以二聚体的形式与其受体相互作用[10]。所以, 本实验中通过定点整合技术, 首先在HEK29316工程细胞株中, 稳定表达了EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体。与外源基因以随机整合的形式插入受体细胞基因组中的传统表达技术相比较, FlpInTM定点整合表达技术可将外源基因插入到宿主细胞基因组中的一个特定的单拷贝位点上(往往是高转录区), 基因拷贝数确定, 外源基因在各克隆之间的表达水平接近, 因此, 该系统是基因文库筛选的有用工具和实现外源基因高效表达有效途径[11]。我们利用FlpInTM系统中表达Flp重组酶的pOG44质粒（起催化同源基因重组的作用）,  介导MAPPIT系统中重组载体pCEL2f/HAb18GEF（潮酶素B基因5′端插入FRT位点）在HEK29316工程细胞基因组的FRT盒处进行定点整合, 从而使原基因组中Laczeocin表达单元被灭活（即表现为对Zeocin敏感）, 同时EpoR/LRF3/HAb18GEF融合基因在HEK 29316细胞的基因组中稳定表达。仅通过1个月的筛选, 便得到12株阳性克隆, 其中1株现已传代10次, 其仍能稳定表达EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体。以上表明, FlpInTM定点整合系统确是一种高效稳定表达外源基因的技术, 定点整合表达EpoR/LRF3/HAb18GEF嵌合受体的HEK29316工程细胞株的建立, 为进一步利用MAPPIT系统筛选成纤维细胞上HAb18G/CD147分子的受体奠定了的基础。

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　　基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30400246)

　　（第四军医大学基础部细胞生物学教研室暨细胞工程研究中心, 陕西 西安 710032; 比利时根特大学医学系医用蛋白研究室 佛兰德斯校际生物技术研究所, 比利时 根特 B9000）


 


  
《细胞与分子免疫学杂志》2007年3月第23卷第3期