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广东省汉族人群与西藏自治区夏尔巴人群SPA基因单核苷酸多态性研究
http://www.100kang.com 2007-5-30 17:30:44 表面活性物质相关蛋白A;


　　Single nucleotide polymorphisms study of surfactant protein A gene between Tibet Sherpas and Guangdong Chinese Hans

　　WANG Shengwei,SUN Xuechuan*,    LIU Kunxiang

　　Institute of Biomedical Engineering, West China Medical Center, Sichuan University, Chengdu 610041; Medical College, Yanan University, Yanan 716000; Physical Education College of PLA, Guangzhou 510500, China

　　[Abstract]  AIM: To investigate the relationship between single nucleotide polymorphisms（SNPs） of  surfactant protein A(SPA) gene of Chinese Han and Sherpas and their adaptation to high altitude hypoxia. METHODS: The genotypes of 90 Chinese Han in Guangdong and 104 Sherpas in Tibet were analyzed by sequence special primer polymerase chain reaction(SSPPCR) sequencing the surfactant protein A gene. RESULTS: The frequencies of genotypes and alleles at SPA1 1544 locus showed no difference between the Sherpas and the Chinese Han (P>005). However, the frequencies of genotypes C/C, C/T and T/T at SPA1 3241 locus were 750%, 221% and 29%, respectively in Sherpas, difference to Han population, they were 500%, 356% and 144%, respectirely(P<005). Whilst in Sherpas allele frequencies of C and T were 861% and 139% respectively but they were 678% and 322% respectively in the Chinese Han(P<005); The frequencies of C/C, A/C and A/A at SPA2 3265 locus were 375%, 538%, and 87%, respectively in the Sherpas were also difference to Chinese Han, they were 633%, 300%, and 67%, respectively. Whilst allele frequencies of C and A were 644% and 356% in Sherpas but 783% and 217% in Chinese Han, which showed statistically difference  between two groups(P<005). CONCLUSION: There were statistically differences of genotypes and alleles at SPA2 3265 locus in Hans and Sherpas. SNP in SPA2 at 3265 may be related to the adaptation of Sherpas to high altitude hypoxia.

　　[Keywords]surfactant protein A; singlenucleotide polymorphism;  hypoxia; adaptation

　　[摘 要]  目的: 通过对肺表面活性物质相关蛋白A(surfactant protein A, SPA)基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）在广东汉族人群和西藏夏尔巴人群中的分布特点的分析, 探讨其与高原低氧环境适应性的关系。方法: 应用序列特异性引物聚合酶链反应（polymerase chain reactionsequence specific primer, SSPPCR）方法, 对90名广东汉族人和104例西藏夏尔巴人SPA基因进行检测。 结果: 在104例夏尔巴人和90名汉族人之间SPA1基因1544位点各基因型和等位基因分布无统计学差异(P>005); 在SPA1基因3241位点C/C, C/T和T/T 3种基因型的构成比在夏尔巴人分别为750%, 221%和29%, 而广东汉族人群为500%, 356%和144%, 夏尔巴人等位基因C、 T的分布频率为861%和139%, 而广东汉族为678%和322%, SPA1 3241基因型和等位基因分布频率在两组之间比较差异有统计学意义（P<005）; 在SPA2基因3265位点夏尔巴人C/C, A/C和A/A 3种基因型的构成比分别为375%, 538%和87%, 广东汉族为633%, 300%和67%,   两组比较差异有统计学意义（P<005）, 而且夏尔巴人等位基因C、 A的分布频率为644%和356%, 而广东汉族人群为783%和217%, 两组比较差异有统计学意义（P<005）。结论: 夏尔巴人SPA2基因的3265位点基因型和等位基因分布与广东汉族人均有显著性差异, 该位点SNP可能与夏尔巴人对高原低氧适应有关。

　　[关键词]表面活性物质相关蛋白A; 单核苷酸多态性; 低氧; 适应性

　　单核苷酸多态性, 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。在基因组DNA中,位于编码区内的SNP(coding SNP, cSNP)是高度稳定的, 部分cSNP可能会直接影响产物蛋白质的结构和基因表达水平, 因此, 它们本身在遗传学的研究中可能具有重要意义。编码肺表面活性物质相关蛋白Ａ的基因SPA1和SPA2存在单核苷酸多态性。许多证据表明长期生活在喜马拉雅地区相对隔离的种族群夏尔巴人能很好地适应他们所处的低氧环境。以往对高原低氧适应机制的研究主要集中在器官、 组织及细胞水平上, 对遗传与环境因素的作用缺乏研究[1]。鉴于SPA在维持正常肺功能中的重要性, 故本研究从SPA基因多态性方面来探讨不同人群高原低氧环境的适应性问题。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  随机选取104名纯血统夏尔巴人, 年龄范围18～47岁, 平均（26±53岁）; 90名健康体检广东汉族人, 年龄范围20～42岁, 平均（28±41岁）。两组受试者均为无血缘关系,无心脑血管疾病和呼吸系统疾病的健康人群。实验中所用引物及主要试剂均由中山大学达安基因中心提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  血样采集  2005年4月在西藏采集104名夏尔巴人外周静脉血2 mL于EDTA真空抗凝管中, 将抗凝管置于-20℃冰箱保存,随后用冰盒空运回广州。同年7月在广东佛山以相同条件采集90名健康体检汉族人2 mL外周静脉血。

　　1.2.2  基因组DNA的提取  将冻存的EDTA抗凝血在室温下阶梯式解冻、 混匀, 取250 μL全血, 加入6 mol/L碘化钠, 再加以氯仿、 异丙醇, 最后用370 g/L异丙醇沉淀DNA, 干燥后溶于TE缓冲液中, -20℃保存备用。另取5 μL TE DNA溶解液, 用双蒸水稀释至600 μL, 在紫外分光光度计上测定A260值, 以检测DNA样品的浓度。

　　1.2.3  聚合酶链反应  PCR引物参照基因组数据库提供的序列和有关文献[2]报道设计, 由中山大学达安基因试剂部合成并纯化。采用序列特异性引物聚合酶链反应(SSP PCR)的方法进行扩增。为控制PCR反应的假阴性结果, 同时设计一对内对照基因引物。引物的具体序列如表1所示。PCR扩增体系为50 μL, 其中5×buffer 10 μL, Taq酶20 μL(2 u/μL), dNTPs 04 μL(25 mmol/L), 目的基因上下游引物各10 μL(10 pmol/μL), 内对照上下游引物(10 pmol/μL)的量分别为12 μL（1544A/G）、 15 μL(3241C/T)、 10 μL(3265A/C), 基因组DNA 3 μL, 双蒸水补足至总反应体积50 μL, 在Gene Amp 9700 PCR扩增仪（新加坡Pore公司）中进行扩增。3241C/T反应条件为: ①93℃预变性5 min; ②93℃变性1 min, 70℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 5个循环; ③93℃变性1 min, 65℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 21个循环; ④93℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸 1 min, 9个循环; ⑤72℃延伸7 min。1544A/G和3265A/C位点PCR扩增条件相同, 具体如下: ①93℃预变性7 min; ②③④步退火温度分别为65℃, 58℃和50℃, 72℃延伸时间为15  min, 其余与3241C/T相同; ⑤72℃延伸10 min。

　　1.2.4  SPA基因多态性分析  每一份模板均需扩增两管, 分别加入两种不同的特异性引物对进行扩增, 取PCR扩增产物8 μL, 经含溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶上电泳, 紫外凝胶成像仪（南京捷达JEDA801E专业数码凝胶成像分析系统）鉴定PCR产物, 根据扩增片段的大小和有无确认受试者的基因型。若同一模板的两份扩增产物电泳后仅有一管出现扩增条带, 则此样本为含有该特异性引物所对应碱基的纯合子基因型; 如两管均出现相应扩增条带, 则为含有对应碱基的杂合子。

　　表1  引物序列和等位基因特异产物（略）

　　Tab 1  Primer sequences and allele specific product

　　1.2.5  统计学处理  以HardyWeinberg检验确认样本的群体代表性, 基因频率采用基因计数法计算, 基因型构成比和等位基因分布频率比较采用χ2检验, 研究对象与基因遗传平衡规律的吻合度采用χ2检验。上述数据处理均运用SPSS115统计软件进行分析, 以P<005为具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  HardyWeinberg遗传平衡检验  在SPA基因中, 两组实验对象各种基因型的分布符合HardyWeinberg平衡规律（表2）, 说明本实验人群具有群体代表性, 可反映整体人群基因的分布情况。

　　表2  各种基因型HardyWeinberg平衡结果（略）

　　Tab 2  The result of genotype balance HardyWeinberg

　　2.2  SPA基因的突变位点及突变规律  应用设计的引物及扩增条件, 每个位点均出现3种基因型: SPA1 1544有A/A纯合型, A/G杂合型和G/G纯合型; SPA1 3241有C/C纯合型, C/T杂合型和T/T纯合型; SPA2 3265出现C/C纯合型, A/C杂合型和A/A纯合型。3个位点扩增产物的片段长度分别为959 bp, 577 bp和588(9) bp, 未见非特异性扩增条带(图1)。

　　2.3  SPA基因型构成和等位基因分布频率的比较  通过对104名夏尔巴人和90名广东汉族人SPA1 1544A/G, SPA1 3241C/T和SPA2 3265C/A 3个SNP位点进行分析, 结果如表3所示, 1544位点夏尔巴人A/A, A/G, G/G基因型构成比分别为433%, 510%和58%, 而在汉族人3种基因型分别为567%, 411%和22%, 两组间无统计学差异（P>005）; 3241位点夏尔巴人C/C, C/T, T/T基因型构成比分别为750%, 221%和29%, 而在汉族3种基因型分别为500%, 356%和144%, 两组间比较有统计学差异(P<005), 而且, 夏尔巴人C等位基因占861%高于汉族678%, 差异有统计学意义(P<005); SPA2 3265位点夏尔巴人C/C, A/C和A/A 3种基因型的构成比分别为375%, 538%和87%, 而汉族对照组为633%, 300%和67%, 两组比较有统计学差异（P<005）, 夏尔巴人等位基因A的分布频率为356%显著高于平原汉族对照组的217%（P<005）。

　　图1  SPA1 1544、 SPA1 3241、 SPA2 3265位点基因型的凝胶电泳图（略）

　　Fig 1  Agarose gel electrophoresis of SPA1 1544, SPA1 3241, SPA2 3265 genotype

　　A: SPA1 1544 genotype; B: SPA1 3241 genotype; C: SPA2 3265 genotype.

　　表3  SPA基因型构成及等位基因分布频率比较（略）

　　Tab 3  ComparisonsoftheGenotypicandthedistributionofAllelefrequenciesatVariableLociofSPAgenebetweenHansandSherpasgroup

　　3  讨论

　　人的SPA基因定位于10q2223, 包含两个功能基因SPA1、 SPA2和一个假基因, 具有高度多态性。其中位于A1基因编码区的1544, 3241和A2基因编码区的3265位点为最主要的突变点[3]。A1基因1544A/G为同义突变,氨基酸未发生变化; 3241C/T变异使219位氨基酸由精氨酸（CGG）→色氨酸（TGG）。A2基因3265A/C变异使223位氨基酸由赖氨酸（AAG）→谷氨酰胺（CAG）。资料报道SPA基因单核苷酸多态性与多种肺部疾病的易感性和发病机理有关[5]。高原肺水肿(highaltitudepulmonaryedema,HAPE)是最常见的一种高原特发病, 但其发病机制尚未完全阐明。低氧可通过NFκB途径促进巨噬细胞对前炎症因子TNFα和IL6基因的转录和表达, TNFα的大量释放可导致血液循环功能紊乱, 内皮通透性增加, 引起包括肺在内的多器官炎症[4], 肺部的炎症反应和自由基介导对肺的损伤引起毛细血管通透性增加是形成HAPE的潜在病因[5]。最近研究提示, HAPE的易感性可能与免疫遗传有关。HAPE患者肺泡气血屏障有“漏孔”的存在, 认为这种“漏孔”的出现和缺氧所致的体液免疫有关, 是HAPE发生的重要环节[6]。Walther等[7]发现SPA可使Ⅱ型肺泡上皮细胞对脂质体包埋的超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶的摄取增加2倍, 有助于提高Ⅱ型肺泡上皮细胞的抗氧化能力。SPA可以以剂量依赖的方式下调促炎细胞因子如: TNFα、 白细胞介素（IL）1β、 巨噬细胞炎症蛋白（MIP）1α及单核细胞趋化因子（MCP）1的产生, 从而抑制某些细胞因子和炎症介质的合成与释放, 抑制炎症反应[8]。SPA还可直接作用于B淋巴细胞或间接通过刺激免疫细胞产生细胞因子作用于B淋巴细胞, 激活该细胞产生免疫球蛋白IgG、 IgA、 IgM[9]。因此说, SPA是呼吸系统中重要的防御物质, 具有抗炎、 抗氧化、 调节局部免疫和炎症反应作用, 并且可用来评价肺气血屏障的完整性。本实验结果表明, 在SPA基因编码区的3个SNP位点中, 引起氨基酸改变的2个SNP位点A1 3241C/T和A2 3265A/C的基因型构成和等位基分布的频率在平原汉族和夏尔巴人之间差异有统计学意义(P<001)。夏尔巴人在SPA2基因 3265A/C与高加索人[2]基因型构成和等位基因的分布均有显著性差异,夏尔巴人携带等位基因A的频率为356%, 显著高于平原汉族217%和高加索人的210%, 而平原汉族人和高加索人之间却很接近。Saxena等报道SPA2基因 aa223位为谷氨酰胺（CAG)的个体高原肺水肿的易感性增加, 而且与aa223位为赖氨酸（AAG)的个体相比, 丙二醛和乳酸脱氢酶增加, 还原型谷胱甘肽减少, 说明其氧化损伤加重, 细胞膜通透性增加[5]。Wang等也认为aa223位包含谷氨酰胺（CAG)的个体诱发产生的细胞因子TNFα的量显著高于aa223位为赖氨酸(AAG)的个体[10]。均与本实验夏尔巴人在SPA2 3265位点A等位基因占优势的结果一致。提示SPA2 3265位点A等位基因可能为一保护基因,通过影响机体的免疫反应, 减轻氧化应激和炎症的损害作用, 而降低了夏尔巴人对高原肺水肿的易感性。说明了对高原低压低氧环境具有良好适应性的夏尔巴人对高原肺水肿具有抵抗性可能有其遗传基础, 是环境（如低压低氧）和遗传因素共同作用的结果。通过对中国广东平原汉族人群和西藏夏尔巴人SPA基因多态性的研究, 有助于我们了解不同基因型在人群中的分布特点, 并从基因水平上认识不同种族、 民族间高原病发病率的不同和不同临床表现的内在机理的差异, 还将为大规模的筛选低氧易感人群提供可能, 因而具有重要的经济和军事意义。

　　参考文献:

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　　基金项目: 军队总参谋部指令性课题基金资助（2004年）

　　（四川大学华西医学中心生物医学工程研究室, 四川 成都  610041; 延安大学医学院病理生理学教研室, 陕西 延安 716000; 解放军体育学院, 广东 广州  510500）

 


  
《细胞与分子免疫学杂志》2007年3月第23卷第3期