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激动型抗41BB抗体3H3交联促进CD8+T细胞中Akt激酶活性
http://www.100kang.com 2007-5-30 17:30:17 41BB;


　　Promotion of the activity of Akt in CD8+ T cells by the crosslink of 3H3, an agonist antibody of 41BB

　　YANG Zhao, FU Xiaolan, SHANG Xiaoyun, NIU Wei, WU Yuzhang, WANG Li*

　　Institute of Immunology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　[Abstract]  AIM: To investigate whether 41BB could promote the proliferation and survival of CD8+ T cells proliferation, and the activity of protein kinase B (Akt). METHODS: highly purified CD8+ T cells were separated and stimulated by CD3 antibody. The crosslink of 3H3 and the proliferation and antiapoptosis of CD8+ T cells were examined. RESULTS: The crosslink of 3H3 promoted the proliferation and survival of CD8+ T cells. 41BB induced by 3H3 promoted the phosphorylated level and kinase activity of Akt. CONCLUSION: Akt pathway might participate in 41BB which promoted the proliferation and survival of CD8+ T cells induced by 3H3.

　　[Keywords]41BB; 3H3; CD8+ T cell; Akt kinase

　　[摘 要]  目的: 研究41BB信号促进CD8+ T细胞增殖、 存活及Akt活性的变化。方法: 利用小鼠CD8α+ T细胞磁珠负性分选试剂盒制备高纯度CD8+ T细胞, 并通过体外抗CD3单克隆抗体（mAb）刺激活化CD8+ T细胞。再通过流式细胞术(FCM)分析3H3交联与否, 四唑盐（WST1）/ECS检测CD8+ T细胞的增殖程度, Annexin V检测抗凋亡能力, 免疫印迹法分析胞内Akt磷酸化水平及Akt激酶活性。结果: 3H3交联可以明显促进活化的CD8+ T细胞增殖和存活, 并且3H3介导的41BB信号可明显促进CD8+ T细胞内Akt磷酸化水平及Akt激酶活性。结论: Akt途径可能参与了3H3交联介导的41BB信号对CD8+ T细胞增殖与存活的调节效应。

　　[关键词]41BB; 3H3; CD8+ T细胞; Akt激酶

　　正常T细胞激活至少需要两种信号, 其一是T细胞受体（TCR）识别多肽抗原MHC复合物; 其二是T细胞共刺激分子与抗原提呈细胞（APC）上的相应配体相互作用。T细胞共刺激信号对于T细胞的活化、 存活及功能具有重要作用, 如T细胞表面CD28与APC上的B71(CD80)和B72(CD86)结合后, 能够促进T细胞增殖, 并增强细胞因子的产生[1]。41BB是另一种非常重要的共刺激分子, 它与其配体41BBL属于肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子（TNFR/TNF）超家族, 相对分子质量（Mr）为35000左右, 是激活诱导表达的I 型膜糖蛋白。41BB与其配体相互作用, 可以促进T细胞活化、 增殖及细胞因子分泌, 增强抗凋亡分子BclxL及Bfl1的表达以抑制凋亡, 维持T细胞存活[2]。目前对于41BB调节T细胞存活的分子机制尚不清楚, 研究提示某些抗凋亡信号途径有可能参与了该效应机制[3]。Akt,  又名蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）在多种类型的细胞中是作为存活因子存在, 具有抑制细胞凋亡及调节细胞周期的作用, 有可能在41BB/41BBL信号传导中起作用[4]。我们利用41BB激动型单克隆抗体（mAb）3H3, 研究41BB信号在促进CD8+ T细胞增殖及存活中, Akt途径的变化, 初步证实Akt参与41BB信号介导的CD8+ T细胞增殖与存活。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  SPF级近交系雌性BALB/c小鼠, 6～8周龄, 体质量20 g, 购自本校实验动物中心。小鼠CD8+ T细胞磁珠阴性分选系统购自Miltenyi公司、 FITC标记的抗小鼠CD8、 PE标记的抗41BB和PECY5标记的抗小鼠CD3 mAb及同型对照抗体购自BD Pharmigen 公司。功能级抗小鼠CD3 mAb、 激动型抗41BB mAb（3H3）及同型对照抗体购自BD Pharmingen, 抗Akt、 磷酸化Akt抗体及非放射性体外Akt激酶分析试剂盒购自Cell Signaling 公司。FITC羊抗小鼠IgG购自北京中山公司。Western blot化学发光系统购自美国NEN 公司。Annexin V凋亡检测试剂盒购自BioVision公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  小鼠CD8+ T细胞的分离鉴定  无菌取脾后, 按照小鼠CD8+ T细胞磁珠负性分选试剂盒（Miltenyi公司）提供的方法制备高纯度小鼠CD8+ T细胞。分离的CD8+ T细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中。取适量细胞标记FITC抗CD8和PECY5抗CD3 mAb鉴定纯度。由本研究所傅晓岚老师提供FACS 检测(Becton Dickinson FACSCalibur)。

　　1.2.2  CD8+ T细胞的体外刺激活化和增殖  将新鲜分离的初始CD8+ T细胞接种到96孔培养板中, 每孔100 μL培养液含5×104个细胞。将细胞分成3组, 分别采用不同处理方式。0 h, 培养孔中加入功能级抗CD3 mAb（05 mg/L）, 孵育至16 h, 取少量细胞标记PE抗41BB, 经FCM分析, 70%以上的细胞呈41BB阳性表达。此时, 在第1组孔中加入激动型抗41BB（3H3）（5 mg/L）, 第2组孔中加入同型对照抗体（5 mg/L）作为阴性对照, 继续孵育至48 h。第3组孔中既不加抗CD3抗体, 也不加3H3, 只用相同浓度的同型对照抗体处理。按照快速细胞增殖分析试剂盒（BioVision）提供的使用说明检测各组部分孔T细胞增殖情况。简言之, 将置于96孔板各孔中; 每孔100μL细胞（5×104个）加10μL 四唑盐（WST1）/ECS溶液, 在标准条件下孵育4 h, 用振荡器彻底振荡1 min。在440 nm波长下检测A值。其余细胞继续孵育至72 h。

　　1.2.3  CD8+ T细胞凋亡检测  参照Annexin V凋亡检测试剂盒使用说明书, 分别检测活化的CD8+ T细胞在用3H3或同型对照抗体处理后24～72 h细胞的凋亡情况。细胞经PECy5Annexin V(BioVision)和7AAD染色后经FCM检测, 重复3 次。

　　1.2.4  免疫印迹法分析CD8+ T细胞Akt磷酸化水平  免疫印迹比较以上法活化的CD8+ T细胞提供41BB信号与否, 在不同时相点, CD8+ T细胞总Akt及Akt磷酸化表达差异。简言之, 经过不同处理的CD8+ T细胞经Ficoll离心得到活的细胞, 用RIPA裂解溶液（10 mL/L NP40、  20 mol/L TrisHCl、 pH76150mol/L NaCl、 5mol/L EDTA、 1mol/L PMSF、 10mg/L Aprotinin 和Leupeptin）, 提取可溶蛋白。SDSPAGE电泳后蛋白转移至NC膜, 化学发光法检测Akt及Akt磷酸化表达情况。

　　1.2.5  CD8+ T细胞Akt激酶试验  同上法收获CD8+ T细胞可溶蛋白, 用非放射性体外Akt激酶分析试剂盒检测。T细胞可溶蛋白用Akt抗体连接的凝胶颗粒免疫沉淀后, 加入冷的ATP和GSK3激酶底物, 在37℃激酶缓冲液中反应1 h, 再做免疫印迹, 检测磷酸化GSK3量。

　　1.2.6  统计学分析  应用SPSS 软件进行处理, 数据用x±s表示, 组间比较采用t检验, P<005 为差异具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  活化的CD8+ T细胞增殖和存活情况  用小鼠CD8α+ T细胞磁珠负性分选试剂盒（Miltenyi公司）制备的CD8+ T细胞经过FITC抗CD8和PECY5抗CD3 mAb双色标记后, 经FCM检测, 纯度达90%以上（图1）。抗CD3抗体联合抗41BB抗体3H3处理组、 抗CD3抗体联合同型对照抗体处理组, 以及同型对照抗体处理组CD8+ T细胞的增殖程度及抗凋亡能力（图2）, 同型对照抗体处理组的CD8+ T细胞在与单纯用抗CD3抗体刺激的T细胞相比, 增强了27倍（P<005）。当CD8+ T细胞用抗CD3、 抗CD28抗体联合3H3处理后24 h细胞存活率与3H3未处理组相比, 无统计学差异（P>005）; 48 h时, 单纯抗CD3抗体处理组的细胞存活率快速降低至（374±16）%, 而联合3H3处理组的细胞存活率为（533±25）%; 在72 h时单纯抗CD3抗体处理组的细胞存活率仅为（225±09）%, 而联合3H3处理组仍有（379±11）%的细胞存活（组间具有显著的统计学差异, P<005）。

　　图1  小鼠CD8+ T细胞经磁珠负性分选前后的纯度图（略）

　　Fig 1  Purity of CD8+ T cell from spleens of BALB/c mice before and after MACS negative magnetic separation

　　A: Before MACS negative magnetic separation; B: After MACS negative magnetic separation.

　　图2  不同抗体刺激后的CD8+ T细胞的增殖情况（略）

　　Fig 2  Proliferation of CD8+ T cells treated with various antibodies

　　2.2  CD8+ T细胞Akt磷酸化水平情况  CD8+ T细胞Akt磷酸化水平结果见图3。与同型对照抗体处理组相比, 给予3H3处理24 h后, CD8+ T细胞中Akt磷酸化水平增加了40%; 在3H3处理72 h后, Akt磷酸化水平增加了90%; 但两组细胞可溶性Akt蛋白水平无统计学差异。第4天, 经3H3处理的CD8+ T细胞Akt磷酸化水平仍保持在相当水平, 而未经3H3处理的T细胞Akt磷酸化水平显著降低（结果未显示）。

　　图3  3H3刺激后CD8+ T细胞的Akt磷酸化水平的增加（略）

　　Fig 3  Upregulation of Akt phosphorylation in CD8+ T cells by stimulation with 3H3 antibody

　　1,3: Rat IgG2a （5 mg/L）;  2,4: 3H3 （5 mg/L）; a: 24 h; b: 72 h.

　　2.3  CD8+ T细胞Akt激酶活性情况  与同型Rat IgG2a处理组相比, 给予3H3处理24 h后, CD8+ T细胞中GSK3磷酸化水平增加了50%; 在3H3处理72 h后, CD8+   T细胞GSK3α/β磷酸化水平比同型Rat IgG2a处理组高出80%（图4）。提示由抗41BB mAb 3H3介导的41BB信号可明显促进CD8+ T细胞Akt激酶活性。

　　图4  3H3刺激后CD8+ T细胞的Akt激酶活性增加（略）

　　Fig 4  Upregulation of Akt kinase activity in CD8+ T cells by stimulation with 3H3 antibody

　　1（24 h）, 3（72 h）: Treated with 5 mg/L isotype Rat IgG2a; 2（24 h）, 4（72 h）: Treated with 5 mg/L 3H3; a: 24 h; b: 72 h.

　　3  讨论

　　免疫共刺激信号在机体正常免疫应答及自稳控制中发挥重要作用。利用共刺激信号在防治免疫耐受性疾病, 自身免疫性疾病等非感染性疾病, 抗肿瘤及器官移植中已证明有较好的应用价值[5]。41BB/41BBL（CD137/CD137L）是一对T细胞活化及存活起重要作用的共刺激分子。本研究表明, 活化的CD8+ T细胞表面41BB表达显著上调, 交联激动型抗41BB mAb 3H3后, T细胞增殖能力及抗凋亡能力均能得到显著增加。研究41BB/41BBL调节T细胞（尤其是CD8+ T细胞）存活的分子机制, 对于阐明41BB/41BBL信号传导及临床应用具有重要意义。有研究认为, TNF受体相关因子2(TRAF2)主要与抗凋亡的信号转导有关。41BB与41BBL结合后发生聚集, 可能通过TRAF2NIK通路活化NFκB, 从而抑制活化诱导的细胞凋亡(AICD)[6]。但也有研究表明, 41BB过度表达可活化蛋白激酶P38和JNK, 故其信号传递也可能与P38MAPK和JNKSAPK通路有关[7]。因此NFκB和P38均被证实具有凋亡保护功能。但是已有文献报道使用NFκB和P38抑制剂后, 只能部分削弱41BB介导的抗凋亡效应, 提示还有其他重要途径参与了该效应。Akt位于磷酯酰肌醇3激酶（Phosphoinositide 3Kinase, PI3K）的下游。Akt在其几个部位的色氨酸/苏氨酸上磷酸化而激活, 活化后的Akt抑制细胞凋亡主要有两条途径: 其一通过磷酸化Bad、 Bim等, 使Bcl2、 BclxL/Bad等复合物解聚, 直接或间接上调BclxL、 Bcl2表达[8]; 其二通过增强抑制性κB激酶α(IKKα)的功能而最终激活NFκB[9]。本研究显示, 初始T细胞活化后磷酸化的Akt及Akt激酶活性增高到第2天, 然后逐渐降低; 41BB共刺激信号可通过Akt途径控制CD8+ T细胞的寿命。用41BB抗体刺激正常活化的T细胞能明显增强磷酸化的Akt及Akt激酶活性, 而未用41BB抗体刺激的T细胞, 磷酸化的Akt及Akt激酶活性明显降低。所以, 41BB信号很可能也通过调控Akt信号通路来增强抗凋亡分子BclxL及Bfl1的表达, 抑制细胞凋亡, 从而调控T细胞的增殖、 存活及细胞周期。

　　参考文献:

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　　基金项目: 国家自然科学基金资助项目（30400437; 30300315）

　　（第三军医大学全军免疫学研究所, 重庆 400038）


  
《细胞与分子免疫学杂志》2007年3月第23卷第3期